Krydsning af mangelmutanter Krydsninger af haploide gæstammer med gendefekter

Transkript

1 Claudia Girnth-Diamba, Bjørn Fahnøe og Barbara Wilken Krydsning af mangelmutanter Krydsninger af haploide gæstammer med gendefekter Indledning Livscyklus Gærceller har en særlig livscyklus. De kan formere sig ukønnet ved deling og de kan formere sig kønnet. Når de formerer sig ukønnet sker det ved almindelige mitoser og gærcellerne har dobbelt kromosomsæt (diploide). Når de formerer sig kønnet laver de meiose og danner 4 kønsceller med enkelt kromosomsæt (haploide). Kønscellerne kan dele sig, vi kalder det en haploid stamme og de ligner normale gærceller i mikroskopet. Halvedelen af kønscellerne får kønstype a og halvdelen a (alfa). Hvis to gærceller mødes hvor den ene er af typen a og den anden a vil de smelte sammen og på ny danne en diploid stamme. gen ADE1 og kønsgen a C (Camilla) med defekt gen ade 1, normalt gen ADE2 og kønsgen a. Man kan sammenligne med en togenskrydsning hvor to kønscellerne har ab og Ab. Figur 1: Viser Mortens genotype. Gærcellerne bliver mørkerøde pga. ade2, se teksten. Syntese af adenin I stofskiftet er der oftest mange reaktioner der fører til dannelse af et stof, dvs der er mange mellemprodukter på vejen til det endelige stof. Der er et specifikt enzym der styrer hvert trin på vejen og blokering af et af disse vil dels medføre ophobning af det stof som enzymet skulle omdanne, dels at det endegyldige stof ikke kan dannes. I dette eksperiment bruges 2 haploide stammer, der har defekter i 2 enzymer der styrer syntesevejen for adenin. Normale gener skrives med stort og defekte gener med småt (analog med A a). M (Morten) med defekt gen ade 2, normalt Figur 2: Viser Camillas genotype. Gærcellerne blive lyserøde pga ade1, se teksten 1 Nucleus Forlag og forfatterne, 2008

2 Når et gen i adenin-biosyntesen er defekt, skal stammen have tilført adenin, ellers vil den dø. Når man dyrker de to ade-defekte stammer på YPD agar der, kan de vokse, fordi de får tilført adenin gennem næringsmediet i agaren, sammen med mange andre organiske stoffer. Derfor kalder vi dette medium for fuldmedium. Gendefekten gør, at et eller flere mellemprodukter i adeninsyntesen ophobes (figur 3). I Morten mangler enzymet, der forarbejder det røde mellemprodukt videre til et farveløst andet produkt. Derfor er stammen mørkerød. I C (Camilla) mangler det næste enzym i rækken, dvs. det røde mellemprodukt forarbejdes videre til et farveløst andet produkt, men stopper dér pga. enzymmangel. Stammen bliver dog lyserød efter nogle dages vækst, fordi - når der er fyldt godt op med det farveløse stof - ophobes der også lidt af det røde stof (figur 4). Vi krydser i forsøget stammerne på et medium (YNB) der ikke indeholder adenin. Dvs. stammerne selv kan ikke vokse. Figur viser 4 stammer, hvoraf 3 har en genetisk defekt. Camilla og Morten har defekt i adeninsyntesen og bliver mere eller mindre røde, som beskrevet. Sammme pricip gælder også for andre metaboliske mutanter, f.eks. Anne. Stammen har en gullig farve pga ophobning af et gulligt mellemprodukt i en anden biosyntesevej. Xenia derimod er en såkaldt vildtype, den har ingen genetiske defekter. Stammen er hvid og kan i modsætning til de andre vokse på minimalmedium (YNB) (figur 5)) Syntesevejen for adenin: Udgangnstoffer -> -> Stof-x(rødt)-> Stof-y (farveløst) -> Stof-z -> -> adenin Figur 3: ADE2-genet medfører enzym der omdanner stof-x, der er rødt til stof-y, der er farveløst. ADE1-genet medfører enzym der omdanner Stof-y til Stof-z. Defekte gener danner ikke Figur 5: enzymer og de tilhørende stoffer omdannes ikke, men ophobes. Figur 4: Viser stammerne på YPD. Her ses også stammerne Anne og Xenia, som evt. også kan inddrages. Se ellers "En simpel undersøgelse af gær's genetik". Gær's livscyklus og genetik Figur 5: Viser at kun Xenia kan vokse på YNB Nucleus Forlag og forfatterne,

3 Gærceller findes både som haploide (kun 1 sæt kromosomer, 17) og som diploide (dobelt sæt, 2x17=34). Både kan vokse og formere sig ukønnet, især når der er gode miljøbetingelser. Bliver der mangel på sukker, kan de dilpoide celler indlede en kønnet formering ved at lave meiode. Meiosen ender med 4 haploide celler i en særlig sæk, kaldet ascus (figur/billede??). De kaldes sporer og er modstandsdygtige og kan dermed overleve indtil miljøbetingelser igen bliver bedre. Når sporerne spirer har de to muligheder, de kan vokse og dele sig mitotisk i lang tid, men de kan også smelte sammen og danne en diploid zygote. Zygoten kan igen vokse og dele sig og cykussen er sluttet (figur 6). Når man forsker i industriel genetik, som f.eks. Carlsberg Forskningscenter gør, har man brug for at undersøge sporerne fra en meiose hver for sig. Ved hjælp af mikromanipulation (brug af meget fine glaspinde og mikroskop) kan man tage en ascus og fordele de 4 sporer på tværs af et dækglas med næringsagar (figur 7). Billedet viser sporer fra en krydsning mellem en hvid og en rød haploid gærstamme. Efter meiosen fordeles kromosomerne for den hvide og den røde egenskab ligeligt, dvs Dette er enestående for forskningsarbejdet med gærorganismen, da man så at sige kan opformere dens kønsceller. Det gør det også lettere at planlægge krydsninger end den opgave Gregor Mendel havde i 1800 tallet, da han krydsede og analyserede runde, rynkede, grønne og gule diploide ærteplanter. Figur 6: Vise sporesække med sporer (grønne). Figur 7: Viser gærcyklus. Figur 8: Viser en række små kolonier som er resultatet fra hver sin sporesæk, se tekst. Nucleus Forlag og forfatterne,

4 Materialer Organismer: Haploid stamme M (ade 2, his 2, paringstype alfa) dvs. den har defekte gener i adeninsyntesen og histidinsyntesen, kaldes MORTEN Haploid stamme C (ade 1, his 1, paringstype a), dvs. den har også defekte gener i adeninsyntesen og histidinsyntesen (men andre end M), kaldes CAMILLA Haploid stamme A (paringstype a), kaldes Anne Haploid stamme X (paringstype a), kaldes Xenia Materialer og apparatur, til brug i fælleskab: 500 ml blue cap flasker til YNB mediefremstilling 250 ml blue cap flasker til YPD mediefremstilling 100 ml blue cap flasker til YPD mediefremstilling ca.25 store petriskåle (steril) ca.25 små petriskåle (steril) autoklave varmeskab vægt og vejebakker sterile engangspodenåle. Eller podenåle med platinspids Kemikalier: yeast nitrogen base without aminoacids (stuetemperatur, langtidsholdbar) peptone eller trypton (stuetemperatur, langtidsholdbar) yeast ekstrakt (stuetemperatur, langtidsholdbar)) glukose monohydrat (stuetemperatur, langtidsholdbar) Fremgangsmåde Forberedelser ca. en uge før: Forberedelse af vækstmedier Der laves YPD agar medie i små petriskåle til hele klassen (opskrift 1, se Tips). YPD indeholder bl.a. vitaminer, aminosyrer og DNA byggesten (f.eks. adenin). Den bruges som vækstmedium for de to mangelmutantstammer, da de ikke selv kan opbygge adenin (figur 9). Der forberedes store petriskåle med YNB mangelmedium, en per person / gruppe (opskrift 2, se Tips). YNB indeholder en amin som nitrogenkilde. Kun raske gærstammer kan omdanne denne nitrogenbase til nitrogenholdige organiske molekyler (f.eks.adenin). Pladerne opbevares ved stuetemperatur indtil forsøget. Plader med eventuelle forureninger kasseres, dvs. de autoklaveres sammen med affaldet fra forsøget. Det gøres fordi man jo ikke ved hvilken type organisme der er årsag til forureningen - det kunne jo være en sygdomsfremkaldende organisme. 4 Nucleus Forlag og forfatterne, 2008

5 Podning af stammerne. 4. Stammen Camilla stryges ud i den ene lille petriskål med YPD næringsagar. Det gøres på følgende måde: 5. Tag en steril podenpind, husk at lukke beholderen igen 6. Åben for petriskålen med stammen 7. Skrab med podepinden lidt gærceller fra overfladen 8. Overfør dem til en ny agarplade ved at tegne en bred zikzak linie på overfladen med podenålen. OBS: podenålen må kun glide på overfladen, ikke ridse den (figur 10)! 9. luk agarpladen med to tapestrimler og sæt stammen i varmeskab med hovedet nedad, dvs. bunden af agarpladen skal vise opad. 10. Gør det samme med de andre stammer. Brug en ny podenål HVER gang 11. Lad stammerne vokse det tager omkring 1 uge. Figur 9: Eksempel på ophældning i petriskåle. Fremgangsmåde på forsøgsdagen: 12. Hent stammerne fra varmeskabet og fjern den ene af de to tapestrimler på hver petriskål. 13. Hent en YNB plade per person / gruppe. 14. Tegn et kryds på et stykke papir. 15. Udstrygning af den første stamme ( figur 11). 16. Læg YNB pladen ovenpå krydset. 17. Tag en steril podepind og hent en lille smule fra stamme Morten ved kun at løfte låget på den ene side af petriskålen. 18. Tag podepinden med cellerne til den store petriskål med YNB agar og følg den vandrette steg på krydset, når du fører stammen med podenålen ud på pladen fra Figur 10 Eksempel på udstrygning af stammer, til venstre Morten og til høje Camilla. Nucleus Forlag og forfatterne,

6 venstre til højre (Figur 12). 19. Tag en ny portion med en ny podepind og lav en ny streg ca.5-10 millimeter parallel til den første. 20. Gentag dette så du får 3 parallelle streger med stamme Morten. Mærk i kanten med et M, så du ved startstedet 21. Drej din YNB plade 90 grader mod uret, så de tre parallelle streger peger opad. 22. Tag en ny podepind, hent en portion af den anden stamme Camilla og lav en streg på agaroverfladen fra venstre til højre så den krydser den første stamme. Smid denne pind i affaldet. Mærk i kanten med et C, så du ved startstedet (figur 13) 23. Tag en ny pind (VIGTIGT) og lav en parallel streg med en ny portion Camilla ligeledes fra venstre til højre. Smid også denne pind i affaldet. 24. Tag en ny pind (VIGTIGT) og lav en tredje parallel streg fra venstre til højre. 25. Stammerne (som jo er voksende kønsceller, gameter) skal smelte sammen til zygoter, som skal vokse og formere sig og danne en diploid stamme. 26. Luk petriskålen med to tapestrimler og sæt den i varmeskabet i 2-4 døgn - husk med bunden opad. Figur 11: Viser udstrygning, Se detaljer i figur 9og 10 Figur :12 Udstrygning af første stamme, husk at mærke petriskålen i kanten med M, så du kan finde startstedet. Resultater Lav en skitse over aflæsningsresultaterne. Hvilken farve har cellerne? Hvordan vokser de i forhold til din podning? Figur 13: Udstrygning af anden stamme, Camilla. Kusk at mærke petriskålen i kanten med C, så du kan finde startstedet. 6 Nucleus Forlag og forfatterne, 2008

7 Pædagogiske tips Spørgsmål til diskussion: Hvor på pladerne vokser de forskellige stammer og hvor vokser de ikke? Forklar hvorfor der er forskel i vækst de forskellige steder på pladen. Forklar hvorfor den diploide stamme har denne farve. I hvilket vigtige stoffer indgår adenin? Hvilke egenskaber ville sporerne få hvis krydsningen mellem M og C laver meiose (lav gerne en tegning til forklaringen)? Forberedelse og tidsforbrug Hele forsøget med forberedelserne tager ca dage, alt efter hvor godt organismerne vokser. De enkelte dele går hurtigt så det kan passes ind i enkelttimer Elevernes forudsætninger Forsøget egner sig bedst til A og B-niveau og giver bla. viden om: Almindelig gentik - dominant arv Eksempel på metabolske synteseveje Hvordan man har fået viden om syntesevere Hvorfor en mutation ofte bliver resseciv Øvelse i steril teknik Opskrifter på næringsmedier Opskrift 1: YPD agar (kompletmedium) til ca.24 små petriskåle. Der laves to opløsninger: 2 gange koncentreret YPD: 4 g glukosemonohydrat, 4 g pepton (eller trypton) og 2 g yeast ekstrakt blandes i 100 ml vand i en blue cap flaske, der rummer 250 ml. 2 gange koncentreret agar: 4 g agar opløses i 100 ml vand, ligeledes i en blue cap flaske på 250 ml. Opskrift 2: YNB mangelagar til ca. 25 store petriskåle. Der laves to opløsninger. 2 gange koncentreret YNB: 4 g yeast nitrogen base og 12 g glukosemonohydrat blandes med 300 ml vand i en 500 ml blue cap flaske. 2 gange koncentreret agar (lav 3 flasker): 4g agar opløses i 100 ml vand i en 250 ml blue cap flaske. Der laves 3 flasker, da agaren kan opvarmes i mikrobølgeovn. Men de fleste mikrobølgeovne kan kun tage max 250 ml blue cap flasker i højden. Figur 14: Viser genotypen for krydsingen Figur 15: Viser en del af biosyntesen af adenin. Nucleus Forlag og forfatterne,